Nghiên cứu chức năng và vai trò gene MGG_00245 ở chủng Magnaporthe oryzae phân lập từ cây lúa bị bệnh đạo ôn - NCS. Lê Quỳnh Loan

Tên đề tài: Nghiên cứu chức năng và vai trò gene MGG_00245 ở chủng Magnaporthe oryzae phân lập từ cây lúa bị bệnh đạo ôn
Ngành: Vi sinh vật học
Mã số ngành: 62420121
Họ tên nghiên cứu sinh: Lê Quỳnh Loan
Khóa đào tạo: 2016
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hoàng Dũng, TS. Vũ Văn Vân
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG.HCM
1. Tóm tắt nội dung luận án:
Loài vi nấm Magnaporthe oryzae là tác nhân gây ra dịch bệnh đạo ôn bùng phát trên lúa gạo và các loại cây ngũ cốc khác, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến an ninh lương thực thế giới. Đối tượng nghiên cứu chính của luận án là gene MGG_00245, đây là gene mã hóa cho protein chưa rõ chức năng, và được điều hòa tăng mạnh trong quá trình nấm M. oryzae xâm nhiễm vào vật chủ. Luận án đã tiến hành nghiên cứu chức năng và vai trò gene MGG_00245 ở chủng M. oryzae phân lập từ cây lúa bị bệnh đạo ôn với các nội dung chính sau: (1), Phân tích in silico để khai thác dữ liệu gene mã hóa cho các polysaccharide monooxygenase (PMO) cũng như các gene liên quan khác trong quá trình xâm nhiễm của M. oryzae, từ đó đặt ra câu hỏi giả thuyết về vai trò và hoạt tính PMO của MGG_00245; (2), Biểu hiện tái tổ hợp protein MGG_00245 bằng hệ thống nấm men Pichia pastoris và thu nhận protein tái tổ hợp có độ tinh sạch cao dùng làm vật liệu cho các thí nghiệm về hoạt tính enzyme; (3), Chứng minh hoạt tính PMO họ AA16 của protein MGG_00245 với khả năng xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử cơ chất cellulose tại vị trí C1 của liên kết glycosidic nhờ vào trung tâm hoạt động đơn nhân Cu(II); (4), Tạo các chủng nấm M. oryzae đột biến knock-out gene mã hóa cho PMO và theo dõi quá trình gây bệnh đạo ôn của các thể đột biến trên 25 giống lúa khác nhau nhằm đánh giá vai trò của các PMO trong quá trình gây bệnh đạo ôn.
2. Những kết quả mới của luận án:
Luận án đã tiến hành các nội dung dự đoán chức năng và nghiên cứu thực nghiệm về gene MGG_00245 mã hóa cho enzyme polysaccharide monooxygenase, đồng thời đánh giá sự liên quan của nhóm enzyme này trong quá trình gây bệnh của nấm đạo ôn Magnaporther oryzae. Một số kết quả đáng chú ý đã được ghi nhận như sau:
Các phân tích dữ liệu in silico đã được tiến hành tập trung vào nhóm gene mã hóa cho PMO và enzyme phân giải carbohydrate, từ đó dự đoán chức năng gene và đặt ra giả thuyết về vai trò của các gene này trong quá trình phát sinh bệnh đạo ôn. Luận án cũng đã phân lập thành công chủng nấm gây bệnh đạo ôn, sử dụng chủng bản địa này để tách dòng và phân tích trình tự gene MGG_00245.
Hệ thống biểu hiện và các quy trình sản xuất protein tái tổ hợp MGG_00245 bằng nấm men Pichia pastoris đã được xây dựng. Thử nghiệm sản xuất và thu nhận protein mục tiêu ở quy mô lên men 5L cho hiệu suất thu hồi protein đạt 66,67 mg/L. Protein ở kích thước 40 kDa được tinh chế qua nhiều bước sắc ký và đạt độ tinh sạch > 94%.
Protein MGG_00245 được chứng minh có đầy đủ hoạt tính của một PMO đặc hiệu cellulose thuộc họ AA16. MoAA16 - MGG_00245 xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử tại vị trí C1 của liên kết glycosidic nhờ vào trung tâm hoạt động đơn nhân Cu(II). Ngoài ra, các kết quả thí nghiệm cũng chứng minh rằng MGG_00245 có khả năng tăng cường hoạt tính của cellulase khi cùng hoạt động trong một hỗn hợp xúc tác, từ đó mở ra tiềm năng ứng dụng protein này vào công nghiệp xử lý sinh khối.
Các thể đột biến knock-out các gene mã hóa PMO được tạo thành bằng phương pháp chỉnh sửa gene với CRISPR/Cas9. Đánh giá tương tác của các thể đột biến và vật chủ cho thấy MGG_06069 (AA9) có liên quan đến quá trình gây bệnh đạo ôn trên đa số giống lúa khảo sát trong khi MGG_00245 (AA16) chưa thể hiện rõ vai trò của nó trong quá trình xâm nhiễm như dự đoán. Cơ chế xâm nhiễm và vai trò cụ thể của các PMO trong nấm gây bệnh đạo ôn M. oryzae vẫn chưa được làm rõ, cần tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu này để có đánh giá toàn diện hơn.
3. Các ứng dụng/ khả năng ứng dụng trong thực tiễn hay những vấn đề còn bỏ ngỏ cần tiếp tục nghiên cứu
Những kết quả nghiên cứu trên đã bước đầu chứng minh tiềm năng ứng dụng của protein MGG_00245. Luận án đã bước đầu xây dựng quy trình biểu hiện và tinh chế protein MGG_00245 ở quy mô phòng thí nghiệm (thể tích 5L), từ đó cho phép mở rộng và phát triển các quy trình sản xuất tái tổ hợp protein MGG_00245 cũng như các PMO khác với độ tinh sạch cao phục vụ cho các mục tiêu nghiên cứu và ứng dụng. Protein MGG_00245 được chứng minh có hoạt tính của một PMO với khả năng xúc tác phản ứng oxy hóa khử phân cắt cơ chất cellulose, đồng thời có tác dụng hỗ trợ các enzyme thủy phân tăng cường hoạt tính xúc tác trong hỗn hợp cocktail enzyme. Kết quả này có ý nghĩa học thuật, đóng góp thêm thông tin về một protein mới thuộc họ enzyme AA16; đồng thời mở ra tiềm năng to lớn của protein này nói riêng và họ enzyme AA16 nói chung trong công nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học và các ngành công nghiệp khác liên quan đến sinh khối thực vật vốn đang có nhu cầu phát triển ngày càng cao.
Luận án đã thiết kế quy trình tạo đột biến knock-out gene trên chủng nấm M. oryzae bằng phương pháp kết hợp CRISPR/Cas và sửa chữa đoạn tương đồng để thay thế marker kháng kháng sinh vào vị trí gene mục tiêu. Luận án cũng đã thử nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của gene mã hóa PMO đến khả năng tương tác và xâm nhiễm của M. oryzae trên các giống lúa khác nhau. Kết quả ban đầu cho thấy mặc dù gene MGG_00245 chưa thể hiện rõ vai trò của nó nhưng một loại PMO khác là MGG_06069 đã cho thấy có tham gia trong quá trình xâm nhiễm của M. oryzae trên đa số giống lúa khảo sát. Quy trình tạo đột biến có thể được sử dụng để tham khảo và áp dụng tiến hành chỉnh sửa bộ gene M.oryzae ở nhiều mức độ khác nhau phục vụ cho mục đích nghiên cứu chuyên sâu hơn. Chiến lược thử nghiệm knock-out một loạt các gene liên quan đến con đường chuyển hóa cellulose được đề xuất cho các nghiên cứu tiếp theo để có đánh giá toàn diện hơn về vai trò của PMO và các enzyme phân giải carbohydrate vào quá trình gây bệnh đạo ôn. Ngoài ra các nghiên cứu về việc phát triển chất ức chế PMO như một biện pháp mới để ngăn ngừa và phòng trừ bệnh đạo ôn trên lúa cũng được đề xuất.