Nghiên cứu ảnh hưởng của các đuôi dung hợp His-tag và LysSN-His-tag đầu N lên sự biểu hiện nội bào các protein BgaB, GFP+ và EGFP ở Bacillus subtilis - NCS. Lê Thị Phương Ngân

Tên đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của các đuôi dung hợp His-tag và LysSN-His-tag đầu N lên sự biểu hiện nội bào các protein BgaB, GFP+ và EGFP ở Bacillus subtilis
Ngành: Vi sinh vật học
Mã số ngành: 9420107
Họ tên nghiên cứu sinh: Lê Thị Phương Ngân
Khóa đào tạo: 2019
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Đức Hoàng, GS.TS. Wolfgang Schumann
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐHQG.HCM
1. Tóm tắt nội dung luận án:
Bacillus subtilis là chủng chủ tiềm năng được sử dụng trong nghiên cứu và sản xuất protein tái tổ hợp. Việc phát triển các hệ thống biểu hiện protein cho B. subtilis như cải thiện độ mạnh của promoter và độ bền của mRNA để tăng cường mức độ biểu hiện protein là cần thiết. Ngoài việc tối ưu để tăng mức độ biểu hiện protein thì việc thu nhận protein sau khi biểu hiện cũng là vấn đề cần quan tâm, đặc biệt là các protein cần độ tinh sạch cao. Các khó khăn trong quá trình biểu hiện và thu nhận protein như protein mục tiêu có mức độ biểu hiện thấp, mất hoạt tính sinh học do sự hình thành liên kết tạo thể vùi, tốn công lao động và chi phí cao để tinh chế protein. Những khó khăn này được giải quyết bằng việc phát triển các đuôi dung hợp giúp hỗ trợ quá trình tinh chế cũng như cải thiện mức độ biểu hiện và độ hòa tan của protein mục tiêu. Trong các đuôi dung hợp dùng trong tinh chế protein thì His-tag được sử dụng phổ biến nhất. Để đánh giá được ảnh hưởng của His-tag lên mức độ biểu hiện của protein dung hợp, luận án này được thực hiện và tập trung vào hai nội dung nghiên cứu chính liên quan đến ảnh hưởng của các đuôi dung hợp His-tag và LysSN-His-tag đầu N lên sự biểu hiện nội bào các protein BgaB, GFP+ và EGFP của B. subtilis.
Nội dung thứ nhất của luận án nghiên cứu ảnh hưởng của các trình tự His-tag đầu N lên mức độ biểu hiện protein nội bào ở B. subtilis. Kết quả cho thấy 8xHis-tag làm giảm mức độ biểu hiện của GFP+ và BgaB. Ba trình tự M-6xHis-Thrombin c/s, MEA-8xHis và MRGS-8xHis dung hợp ở đầu N làm giảm mức độ biểu hiện của protein biểu hiện cao GFP+ và làm tăng mức độ biểu hiện của protein biểu hiện thấp EGFP. Đối với protein biểu hiện thấp EGFP dung hợp His-tag đầu N thì có thể tối ưu trình tự His-tag để làm tăng mức độ biểu hiện protein. Đối với protein biểu hiện cao dung hợp His-tag, sự giảm biểu hiện có thể do sự thiếu histidine trong quá trình kéo dài ở pha khởi đầu dịch mã.
Nội dung thứ hai của luận án sử dụng đuôi dung hợp kép LysSN-xHis, kết hợp vùng N-terminus của Lysyl tRNA synthetase của B. subtilis (LysSN) và His-tag, và đánh giá ảnh hưởng lên mức độ biểu hiện và tinh chế protein nội bào ở B. subtilis. Kết quả cho thấy LysSN-6xHis làm tăng mức độ biểu hiện so với His-tag ở cả protein biểu hiện cao và thấp. Số lượng histidine (6xHis, 8xHis, 10xHis) trong đuôi dung hợp kép LysSN-xHis có ảnh hưởng lên mức độ biểu hiện của protein biểu hiện thấp EGFP và không ảnh hưởng đáng kể lên mức độ biểu hiện của các protein biểu hiện cao BgaB và GFP+. LysSN trong đuôi dung hợp kép LysSN-xHis không ảnh hưởng đến sự bám của His-tag với hạt Ni-NTA. LysSN-xHis là đuôi dung hợp kép tiềm năng dùng để biểu hiện và tinh chế protein dung hợp.
2. Những kết quả mới của luận án:
Luận án đã chứng minh trình tự His-tag dung hợp ở đầu N có ảnh hưởng lên sự biểu hiện nội bào các protein ở B. subtilis. His-tag làm giảm mức độ biểu hiện của protein biểu hiện cao (GFP+ và BgaB) và làm tăng mức độ biểu hiện của protein biểu hiện thấp (EGFP) ở B. subtilis. Đánh giá tác động của lysSN và số lượng histidine trong đuôi dung hợp kép LysSN-xHis lên mức độ biểu hiện của các protein biểu hiện cao (GFP+, BgaB) và protein biểu hiện thấp (EGFP) cho thấy LysSN-xHis-tag làm tăng mức độ biểu hiện của các protein mục tiêu so với His-tag. LysSN-xHis-tag là một đuôi dung hợp hiệu quả có thể được sử dụng để sản xuất protein trong tế bào chất của B. subtilis và hỗ trợ quá trình tinh chế.
3. Các ứng dụng/ khả năng ứng dụng trong thực tiễn hay những vấn đề còn bỏ ngỏ cần tiếp tục nghiên cứu
Ứng dụng/khả năng ứng dụng: Kết quả nghiên cứu của luận án này cho thấy ảnh hưởng của đuôi dung hợp His-tag và LysSN-xHis-tag ở đầu N lên mức độ biểu hiện protein trong tế bào chất của B. subtilis. Các kết quả của đề tài tạo cơ sở khoa học cho việc lựa chọn, thiết kế đuôi dung hợp phù hợp với nhu cầu biểu hiện và tinh chế protein mục tiêu biểu hiện ở B. subtilis.
Vấn đề còn bỏ ngỏ cần tiếp tục nghiên cứu: Cho đến nay, đuôi dung hợp dùng để biểu hiện protein trong tế bào chất của B. subtilis chủ yếu giới hạn trong số ít đuôi dung hợp phổ biến và mang tính thử nghiệm như His-tag, Strep-tag, LysSN-tag. Để làm cơ sở dữ liệu cho các ứng dụng biểu hiện và tinh chế protein ở B. subtilis, cần tiếp tục nghiên cứu các đuôi dung hợp khác.