Vì sao nên thận trọng khi làm xét nghiệm COVID-19 bằng real-time RT-PCR với mẫu gộp?

ThS. Nguyễn Thành Khôi, Công ty TNHH Merck Việt Nam
--------

Để hiểu xét nghiệm COVID-19 bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR với mẫu gộp là gì thì trước tiên chúng ta cần xem lại một quy trình xét nghiệm cho mẫu đơn là như thế nào. Quy trình được tóm tắt bằng 5 bước cơ bản trong Hình 1 (phần a.): (i) thu mẫu dịch hầu họng bằng que phết (swab), 1 que cho 1 người; (ii) trữ que phết vào dung dịch bảo quản; (iii) tách chiết RNA từ dung dịch; (iv) nhân bản các vùng gen của SARS-CoV-2 bằng máy Real-time PCR; (v) đọc kết quả.

Vậy xét nghiệm bằng phương pháp mẫu gộp (pooled sample) là gì? Đó là, trước khi chuyển sang bước (iii) ở Hình 1, chúng ta sẽ tiến hành gộp từ 2 đến 6 mẫu vào thành 1 mẫu đại diện. Mẫu đại diện này gọi là mẫu gộp. Có 2 cách để tạo ra mẫu gộp (Hình 2).

1. Gộp dung dịch (Hình 2A): giả sử có 6 người tham gia xét nghiệm; mỗi người được lấy mẫu bằng 1 que riêng biệt; mỗi que được trữ vào 1 ống riêng biệt; khi đem 6 ống này về phòng xét nghiệm, kỹ thuật viên sẽ hút ra từ mỗi ống một ít dung dịch, ví dụ 200 µL, và dồn chung vào 1 ống mới (ống số 7); ống số 7 này có tổng thể tích là 1200 µL và được gọi là mẫu gộp; kỹ thuật viên sẽ trộn dung dịch trong ống số 7 này cho thật đều và hút ra 200 µL để tách chiết RNA.
2. Gộp que (Hình 2B): cũng với 6 người tham gia xét nghiệm như trên, mỗi người được lấy mẫu bằng 1 que riêng biệt nhưng tất cả 6 que này sẽ được trữ vào chung 1 ống chứa dung dịch bảo quản. Ống này cũng được gọi là mẫu gộp. Trong phần còn lại của bài viết, để lời văn đơn giản hơn, tôi sẽ dùng nhóm từ “mẫu gộp n” để mô tả mẫu gộp từ n mẫu. Ví dụ, mẫu gộp 6 nghĩa là mẫu gộp có được từ 6 mẫu đơn khác nhau.

Sau khi tiến hành tách chiết và phát hiện RNA của SARS-CoV-2 trong mẫu gộp, nếu kết quả:

1. Dương tính: Bắt buộc phải xét nghiệm lại tất cả mẫu đơn tạo nên mẫu gộp đó.
2. Âm tính: Có thể tạm kết luận các mẫu đơn âm tính nhưng phải tham khảo các dữ liệu lâm sàng và dịch tễ của người tham gia xét nghiệm [1,3,4].

Hiện nay có nhiều chiến lược gộp mẫu khác nhau khi làm xét nghiệm SARS-CoV-2. Ngoài hai phương pháp gộp mẫu đã nêu trên, một số nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp gộp RNA, cDNA hay sản phẩm tiền nhân bản (Pre-amplification). Các phương pháp này khác biệt với quy trình Real-time RT-PCR thông thường ở một số điểm như không cần tinh sạch RNA, sử dụng thêm bước tiền nhân bản, sử dụng chất phát quang thay cho mẫu dò TaqMan, áp dụng thuật toán để diễn giải kết quả, v.v… Sự khác biệt này khiến chúng ta khó thực hiện một phép so sánh toàn diện. Trong phạm vi của bài viết này, tôi chỉ tập trung phân tích những vấn đề liên quan đến hai phương pháp gộp mẫu sử dụng trong một quy trình Real-time RT-PCR thông thường như mô tả trong Hình 1 và đang được áp dụng rộng rãi ở Việt Nam cũng như nhiều nước trên thế giới.

ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA MẪU GỘP
----------

Ưu điểm: Xét nghiệm COVID-19 bằng Real-time RT-PCR với mẫu gộp giúp phòng xét nghiệm tăng công suất mà vẫn tiết kiệm được hóa chất, nhân lực và thời gian. Ví dụ: nếu tỷ lệ dương tính trong quần thể là 1%, dùng mẫu gộp 6 (thu từ 6 người) thì 1.000 mẫu gộp sẽ giúp xét nghiệm một cách hiệu quả 4.440 người [1,2].

Nhược điểm: 

• RNA của SARS-CoV-2 có trong mẫu đơn sẽ bị pha loãng trong mẫu gộp nên quy trình xét nghiệm sử dụng mẫu gộp sẽ có độ nhạy kém hơn so với khi sử dụng mẫu đơn [1,2,3,4,5]
• Tỷ lệ nhiễm COVID-19 trong quần thể càng cao thì việc sử dụng mẫu gộp càng kém hiệu quả vì phải xét nghiệm lại mẫu đơn thường xuyên, gây mất thời gian và lãng phí hóa chất [1,2]
• Nếu dùng phương pháp gộp dung dịch thì sẽ tăng nguy cơ nhiễm chéo giữa các mẫu đơn do phát sinh thêm thao tác hút, trộn mẫu.
• Nếu dùng phương pháp gộp que thì bắt buộc phải lấy 2 que cho 1 người (1 que để gộp, 1 que để trữ riêng và được dùng để kiểm tra lại mẫu đơn sau khi mẫu gộp ra dương tính); việc lấy 2 que mẫu/người gây khó chịu cho người tham gia xét nghiệm và kéo dài thời gian tiếp xúc không che chắn với nhân viên y tế. 

MẪU GỘP DUNG DỊCH LÀM GIẢM ĐỘ NHẠY CỦA QUY TRÌNH NHƯ THẾ NÀO?

----------

Đầu tiên, cần phải khẳng định rằng mẫu gộp sẽ làm giảm độ nhạy của quy trình xét nghiệm, tức là một người dương tính yếu với SARS-CoV-2 có thể không được phát hiện trong mẫu gộp với những người âm tính khác (nồng độ virus bị pha loãng trong mẫu gộp). Tôi lấy Hình 3 để minh họa cho vấn đề này. Cụ thể, trong 4 người xét nghiệm thì có 1 người dương tính yếu với nồng độ 5 con virus/mL, 3 người còn lại âm tính. Khi gộp 4 mẫu từ 4 người này lại theo phương pháp gộp dung dịch thì mẫu gộp vẫn sẽ chứa virus nhưng nồng độ đã bị giảm xuống còn 3 con virus/mL. Giả sử ngưỡng phát hiện của quy trình là 4 con virus/mL thì chắc chắn mẫu gộp này sẽ cho ra kết quả âm tính giả.

Tôi diễn giải đơn giản như trên để bạn đọc dễ hình dung. Sau đây, để thuyết phục hơn, mời bạn đọc tham khảo một số nghiên cứu cho thấy hiện tượng giảm độ nhạy do mẫu gộp dung dịch là có thật.

1. Cibali và cộng sự, 2021 [6] (Hình 4): Giá trị Ct của mẫu đơn luôn luôn nhỏ nhất khi so với mẫu gộp 2, 5, 10 và 30. Ngược lại, giá trị Ct của mẫu gộp 10 và gộp 30 luôn cao nhất. Theo nguyên lý Real-time PCR, giá trị Ct càng nhỏ thì nồng độ virus trong mẫu càng cao. Như vậy, thông tin này chứng tỏ khi bị gộp với càng nhiều mẫu âm tính thì lượng virus có trong mẫu đơn ban đầu sẽ càng bị pha loãng. Điều này theo tôi thật ra cũng dễ dự đoán được.

Tuy nhiên, tôi đặc biệt chú ý đến một kết luận của nghiên cứu này. Khi xét nghiệm mẫu gộp, hai sinh phẩm (kit) thương mại của hãng Cepheid và hãng Inno-train Diagnostik chỉ cho kết quả đúng nếu nồng độ virus trong mẫu đơn ban đầu đạt tối thiểu là 30.000 virus/mL. Đây có thể được xem là một ví dụ về ngưỡng phát hiện (LoD) của quy trình xét nghiệm dựa trên mẫu gộp. Giá trị LoD này đang cao gấp 200 đến 1000 lần so với giá trị LoD của một quy trình Real-time RT-PCR cho mẫu đơn thông thường (dao động từ khoảng 30 copies/ml đến 150 copies/mL, tùy sinh phẩm [1]). Nghĩa là việc sử dụng mẫu gộp đang làm giảm đáng kể độ nhạy của quy trình.

2. Praharaj và cộng sự, 2020 [7] (Hình 5). Kết quả xét nghiệm của mẫu gộp 5 phù hợp 88% so với kết quả của mẫu đơn. Trong khi đó, mẫu gộp 10 chỉ cho độ phù hợp ở mức 66%. Phân tích sâu hơn nữa thì chúng ta sẽ thấy giá trị Ct trung bình của mẫu gộp 5 lớn hơn mẫu đơn là 2,18±1,86; Ct trung bình của mẫu gộp 10 lớn hơn mẫu đơn là 3,81±2,26. Tức là độ nhạy của mẫu gộp 10 kém hơn 10 lần so với mẫu đơn.

3. Wunsch và cộng sự, 2021 [8] (Hình 6). Mẫu gộp 10 cho giá trị Ct lớn hơn 2,3 đơn vị so với Ct của mẫu đơn. Đặc biệt, thiết bị tách chiết và máy Real-time PCR ảnh hưởng lớn đến độ nhạy của quy trình.

4. Perchetti và cộng sự, 2020 [9]. Mẫu gộp 4 cho giá trị Ct lớn hơn 1,7 đến 2 đơn vị so với Ct của mẫu đơn (tùy vùng gen của virus). Có 2 trên 32 mẫu dương tính không phát hiện được bằng mẫu gộp 4 vì giá trị Ct mẫu đơn lớn hơn 35 (nồng độ virus thấp).

5. Barak và cộng sự, 2021 [10] (Hình 7). Nghiên cứu này được thực hiện trên 133.816 mẫu dịch phết, gộp thành 14.697 mẫu gộp 8 và 3.248 mẫu gộp 5. Mặc dù nhóm tác giả đánh giá cao phương pháp sử dụng mẫu gộp khi giúp tiết kiệm đến 76% hóa chất tách chiết RNA và hóa chất RT-PCR, nhưng vẫn còn đó những thống kê chúng ta nên lưu tâm:

• 66-68% các mẫu gộp có chứa 1 mẫu đơn dương tính (Hình 7B)
• Giá trị Ct của 902 mẫu gộp có chứa 1 mẫu đơn dương tính lớn hơn giá trị Ct của mẫu đơn tương ứng là 2.9 đơn vị (Hình 7C). Nói cách khác, quy trình sử dụng mẫu gộp kém nhạy hơn 7,5 lần.

PHƯƠNG PHÁP GỘP QUE CÓ GIÚP ĐẢM BẢO ĐỘ NHẠY?

Trong nghiên cứu của Wunsch và cộng sự đã nêu trên [8], bên cạnh phương pháp gộp dung dịch, nhóm tác giả đã tiến hành song song phương pháp gộp que, mặc dù hình thức hơi khác so với phương pháp tôi đã mô tả. Khi nhìn vào kết quả ở Hình 6, mục A, đồ thị cuối cùng bên phải, chúng ta dễ dàng nhận ra mẫu gộp có giá trị Ct trung bình cao hơn hẳn so với mẫu đơn. Độ khác biệt Ct trong nghiên cứu chỉ ra là 2,36 đơn vị.

Trong một nghiên cứu khác sử dụng phương pháp gộp que, Christoff và cộng sự tiến hành xét nghiệm quy mô lớn trên 19.535 người, gộp thành 1.389 mẫu gộp [11]. Kết quả cho thấy độ lệch giá trị Ct giữa mẫu gộp và mẫu đơn sẽ lớn hơn khi mẫu đơn có giá trị Ct > 35 (Hình 8B, đồ thị bên trái). Với những trường hợp này độ lệch Ct chỉ cần là 1 đơn vị thì đã có thể dẫn đến kết quả âm tính giả. Ngoài ra, khi so sánh ở cấp độ gen mục tiêu, gen RdRp có độ lệch Ct lớn nhất giữa mẫu gộp và mẫu đơn với giá trị cực đại là 2,94 trong khi hai gen còn lại là S và E có độ lệch cực đại lần lượt là 1,17 và 2,66.

Qua hai nghiên cứu trên, chúng ta có thể kết luận dù có sử dụng phương pháp gộp que thay cho phương pháp gộp dung dịch thì độ nhạy quy trình vẫn bị ảnh hưởng. Nguyên nhân tôi đưa ra ở đây là do tính phức tạp của nền mẫu trong mẫu gộp tăng lên nhiều lần so với mẫu đơn, ảnh hưởng trực tiếp đến xác suất thu hồi và hiệu quả nhân bản vùng RNA mục tiêu của SARS-CoV-2. Ngoài ra, chúng ta cũng cần đặc biệt lưu ý đến việc lựa chọn vùng gen mục tiêu để giảm thiểu sự ảnh hưởng này. 

XÉT NGHIỆM BẰNG MẪU GỘP CÓ DẪN ĐẾN DƯƠNG TÍNH GIẢ?

Qua những nghiên cứu được nên trên, chúng ta có thể hiểu rằng quy trình xét nghiệm sử dụng mẫu gộp có thể dẫn đến kết quả âm tính giả. Vậy còn khả năng xảy ra kết quả dương tính giả thì sao? 

Trong nghiên cứu sử dụng phương pháp gộp dung dịch của Barak và cộng sự [10], có một tỷ lệ nhỏ mẫu gộp (3,9% – 5,3%) cho kết quả dương tính nhưng tất cả các mẫu đơn liên quan lại cho kết quả âm tính. Giá trị Ct trung bình của những mẫu gộp bất thường này dao động từ 34,2 đến 36,8. Chúng ta có thể gọi đây là các kết quả dương tính giả.

Hiện tượng dương tính giả này cũng được nêu trong nghiên cứu sử dụng phương pháp gộp que của Christoff và cộng sự [11]. Nhóm tác giả phát hiện có 12 mẫu gộp (chiếm 0,86% tổng số mẫu) cho kết quả dương tính nhưng tất cả mẫu đơn tương ứng lại cho kết quả âm tính. Đáng chú ý, trong số 12 mẫu gộp bất thường này thì có 8 mẫu liên quan đến 2 ngày lấy mẫu (mỗi ngày lấy 4 mẫu). Điều này đưa đến một nhận định rằng có thể nhân viên lấy mẫu trong những ngày này mắc sai sót và gây ra hiện tượng nhiễm chéo giữa các mẫu gộp. 

KẾT LUẬN

----------

Từ những nghiên cứu trên, kết hợp với thông tin khuyến cáo từ CDC Hoa Kỳ, FDA và những hãng sản xuất sinh phẩm xét nghiệm SARS-CoV-2 nổi tiếng như Roche, Abbott, PerkinElmer, tôi cho rằng cần thận trọng đánh giá về độ nhạy của quy trình xét nghiệm COVID-19 khi sử dụng mẫu gộp. Phòng xét nghiệm muốn áp dụng phương pháp mẫu gộp bắt buộc phải có đánh giá về độ tương quan giữa độ nhạy quy trình dùng mẫu gộp so với mẫu đơn. Thiết bị, sinh phẩm, con người là những yếu tố cần phải đưa vào quá trình thẩm định [2,5]. Ngoài ra, xét nghiệm sử dụng mẫu gộp chỉ phát huy tác dụng khi tỷ lệ nhiễm trong quần thể thấp. Tỷ lệ nhiễm tối đa bao nhiêu thì còn phù hợp để làm mẫu gộp thì tôi chưa thấy có con số cụ thể. Con số tham khảo từ các tài liệu tham khảo là 5%, 7%, 10%.

Chúng ta cũng không nên quên một số lưu ý quan trọng trong quá trình gộp mẫu. Nếu dùng cách gộp dung dịch thì lượng dung dịch của mẫu đơn phải còn đủ cho xét nghiệm sau đó, nếu mẫu gộp dương tính. Nếu dùng cách gộp que, phải lấy 2 que cho 1 người để dự phòng cho xét nghiệm mẫu đơn về sau. Số lượng mẫu đơn trong một mẫu gộp thường gặp nhất là từ 2 mẫu đến 6 mẫu [1,3,4] và đặc biệt lưu ý đến thao tác gộp mẫu để hạn chế tỷ lệ dương tính giả [10,11].

Tài liệu tham khảo

1. Tài liệu hướng dẫn sử dụng sinh phẩm cobas® SARS-CoV-2. Roche. https://www.fda.gov/media/136049/download
2. Interim Guidance for Use of Pooling Procedures in SARS-CoV-2 Diagnostic and Screening Testing. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/pooling-procedures.html
3. Tài liệu hướng dẫn sử dụng sinh phẩm SARS-CoV-2 AMP Kit. Abbott. https://www.fda.gov/media/137979/download 
4. Tài liệu hướng dẫn sử dụng sinh phẩm PerkinElmer® New Coronavirus Nucleic Acid Detection Kit. PerkinElmer. https://www.fda.gov/media/136410/download 
5. Pooled Sample Testing and Screening Testing for COVID-19. https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-covid-19-and-medical-devices/pooled-sample-testing-and-screening-testing-covid-19 
6. Cibali, E., Wenzel, J., Gruber, R. & Ambrosch, A. (2021). Pooling for SARS-CoV-2-testing: comparison of three commercially available RT-qPCR kits in an experimental approach. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM), 59(6), e243-e245. https://doi.org/10.1515/cclm-2020-1375.  
7. Praharaj, I., Jain, A., Singh, M., Balakrishnan, A., Dhodapkar, R., Borkakoty, B., Ashok, M., Das, P., Biswas, D., Kalawat, U., Turuk, J., Sugunan, A. P., Prakash, S., Singh, A. K., Barathidasan, R., Subhadra, S., Sabat, J., Manjunath, M. J., Kanta, P., Mudhigeti, N., … Gupta, N. (2020). Pooled testing for COVID-19 diagnosis by real-time RT-PCR: A multi-site comparative evaluation of 5- & 10-sample pooling. The Indian journal of medical research, 152(1 & 2), 88–94. https://doi.org/10.4103/ijmr.IJMR_2304_20  
8. Wunsch, Marie & Aschemeier, Dominik & Heger, Eva & Ehrentraut, Denise & Krüger, Jan & Hufbauer, Martin & Syed, Adnan & Horemheb-Rubio, Gibran & Dewald, Felix & Fish, Irina & Schlotz, Maike & Gruell, Henning & Augustin, Max & Lehmann, Clara & Kaiser, Rolf & Knops, Elena & Silling, Steffi & Klein, Florian. (2020). Safe and Effective Pool Testing for SARS-CoV-2 Detection. SSRN Electronic Journal. 10.2139/ssrn.3684470.  
9. Perchetti, G. A., Sullivan, K. W., Pepper, G., Huang, M. L., Breit, N., Mathias, P., Jerome, K. R., & Greninger, A. L. (2020). Pooling of SARS-CoV-2 samples to increase molecular testing throughput. Journal of clinical virology : the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology, 131, 104570. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104570
10. Barak, Netta & Ben-Ami, Roni & Sido, Tal & Perri, Amir & Shtoyer, Aviad & Rivkin, Mila & Licht, Tamar & Peretz, Ayelet & Magenheim, Judith & Fogel, Irit & Livneh, Ayala & Daitch, Yutti & Djian, Esther & Benedek, Gil & Dor, Yuval & Wolf, Dana & Yassour, Moran. (2020). Lessons from applied large-scale pooling of 133,816 SARS-CoV-2 RT-PCR tests. 10.1101/2020.10.16.20213405. 
11. Christoff AP, Cruz GNF, Sereia AFR, Boberg DR, de Bastiani DC, Yamanaka LE, Fongaro G, Stoco PH, Bazzo ML, Grisard EC, Hernandes C, de Oliveira LFV. Swab pooling: A new method for large-scale RT-qPCR screening of SARS-CoV-2 avoiding sample dilution. PLoS One. 2021 Feb 4;16(2):e0246544. doi: 10.1371/journal.pone.0246544. PMID: 33539474; PMCID: PMC7861376.