Ứng dụng peptide chứa motif đặc hiệu của helicase RHAU làm công cụ nghiên cứu G-quadruplex song song ở vi khuẩn - NCS. Trương Thị Tinh Tươm

Tên đề tài luận án: Ứng dụng peptide chứa motif đặc hiệu của helicase RHAU làm công cụ nghiên cứu G-quadruplex song song ở vi khuẩn
Ngành: Vi sinh vật học
Mã số ngành: 62420107
Họ tên nghiên cứu sinh: Trương Thị Tinh Tươm
Khóa đào tạo: 2016
Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Phan Thị Phượng Trang, PGS TS Đặng Thanh Dũng
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐHQG.HCM
1. Tóm tắt nội dung luận án:
G-quadruplex (G4) là cấu trúc xoắn bốn sợi của DNA hoặc RNA được hình thành ở những vùng trình tự giàu guanine, đóng vai trò quan trọng trong điều hòa hoạt động của tế bào như sao chép, phiên mã, dịch mã và duy trì telomere. Do đó, G4 là phân tử có tiềm năng cho nghiên cứu và ứng dụng kiểm soát hoạt động của tế bào, đặc biệt trong định hướng phát triển các phân tử thuốc nhắm mục tiêu G4 dùng điều trị bệnh ở người bao gồm cả ung thư. Đến nay đã có khoảng 1000 phân tử được chứng minh có ái lực với G4, trong đó helicase RHAU là protein có ái lực cao và gắn đặc hiệu với G4 song song nhờ vào vùng domain nhận biết RSM dài 13 aa. Tuy nhiên, protein RHAU có kích thước phân tử lớn nên nghiên cứu này sử dụng peptide RHAU dài 140 aa (được gọi là RHAU140) có chứa RSM làm domain nhận diện G4 song song với các định hướng: (i) phát triển mẫu dò RHAU140-CFP để phát hiện G4 song song dựa trên đo cường độ huỳnh quang của chỉ thị CFP, (ii) nghiên cứu sự ức chế biểu hiện CFP bởi tương tác giữa RHAU140 với G4 song song trong tế bào E. coli thông qua đo kết quả cường độ huỳnh quang CFP, (iii) khảo sát khả năng nhận diện G4 và cắt DNA tại vị trí đặc hiệu của enzyme nuclease RHAU140-Fok1. Ưu điểm của peptide RHAU140 có độ nhạy cao với đối tượng mục tiêu nhưng kích thước phân tử lớn dẫn đến khó thao tác và ứng dụng nên trong luận án này đã sử dụng kĩ thuật ribosome display để sàng lọc các peptide có kích thước phân tử nhỏ hơn nhiều lần so với RHAU140 nhưng vẫn có ái lực tương đương. Kết quả sau khi sàng lọc thu nhận được 4 peptide RHAU30 có ái lực gắn với G4 song song T95-2T cao. Peptide L10P2 (được đặt tên là RHAU30) có ái lực cao nhất được dùng để đánh giá ái lực gắn với G4 song song. Thứ nhất, so sánh khả năng nhận diện T95-2T của RHAU30-CFP với RHAU140-CFP. Thứ hai, đánh giá khả năng DNA G4 song song cảm ứng sự dimer của hai protein RHAU30-CFP và RHAU30-YFP bằng FRET. Thứ ba, đánh giá khả năng RNA G4 song song (TERRA) cảm ứng sự dimer hóa và hoạt hóa RHAU30-CASP9 thông qua hoạt tính phân cắt cơ chất CASP3 cho ứng dụng cảm ứng tế bào đi vào chu trình chết.
2. Những kết quả mới của luận án:
- Tạo ra được 10 plasmid tái tổ hợp mới
- Tạo ra đầu dò RHAU140-CFP nhận diện được cấu trúc G4 song song T95-2T thông qua đo cường độ phát huỳnh quang CFP.
- Tạo ra enzyme cắt RHAU140-Fok1 và khảo sát các đặc tính cắt DNA.
- Chứng minh được có sự ức chế biểu hiện protein CFP trong tế bào E. coli bởi tương tác giữa G4 song song với RHAU140.
- Tạo được 4 thư viện DNA để sàng lọc bằng ribosome display.
- Thu được 4 peptide RHAUp có ái lực cao với G4 song song T95-2T sau khi sàng lọc ribosome display. Chứng minh peptide RHAU30 có ái lực gắn G4 cao nhất và tương đương với RHAU140.
- RHAU30 cảm ứng sự dimer và hoạt hóa RHAU30-CASP9 thông qua tương tác đặc hiệu giữa G4 và 2 phân tử RHAU30.  
3. Các ứng dụng/ khả năng ứng dụng trong thực tiễn hay những vấn đề còn bỏ ngỏ cần tiếp tục nghiên cứu
Có thể sử dụng đầu dò RHAU140-CFP hoặc RHAU30-CFP để nhận diện cấu trúc G4 song song trong tế bào.
Có thể ứng dụng tương tác giữa RHAU140 với G4 song song để điều hòa hoạt động của tế bào.
Nghiên cứu và tối ưu điều kiện ứng dụng cho peptide RHAU30 thu được từ kết quả sàng lọc ribosome display trong in vitro và in vivo.