Phát triển vector biểu hiện dựa trên promoter Pgrac không sử dụng chất cảm ứng cho Bacillus subtilis - NCS. Trần Thị Minh Định

Tên đề tài luận án: Phát triển vector biểu hiện dựa trên promoter Pgrac không sử dụng chất cảm ứng cho Bacillus subtilis
Ngành: Vi sinh vật
Mã số ngành: 62420107
Họ tên nghiên cứu sinh: Trần Thị Minh Định
Khóa đào tạo: 2015
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Đức Hoàng, GS. Wolfgang Schumann
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG.HCM
1. Tóm tắt luận án
B. subtilis có nhiều ưu điểm để trở thành chủng chủ phù hợp cho sản xuất protein tái tổ hợp. Vì vậy, nhiều vector biểu hiện thuộc nhóm cảm ứng biểu hiện hoặc không sử dụng chất cảm ứng đã được phát triển cho chủng chủ này. Các vector biểu hiện không sử dụng chất cảm ứng ở B. subtilis được ưa chuộng hơn do chất cảm ứng làm tăng chi phí sản xuất và có thể gây độc cho tế bào chủ. Tuy nhiên, phần lớn các vector biểu hiện cho
B. subtilis là vector con thoi, do đó, biểu hiện nền ở E. coli có thể làm giảm hiệu quả của quá trình dòng hoá. Do đó, việc tạo ra các vector không sử dụng chất cảm ứng cho phép biểu hiện protein mục tiêu ở mức độ cao ở B. subtilis mà vẫn có khả năng ức chế sự biểu hiện nền ở E. coli là cần thiết cho sản xuất protein tái tổ hợp. Trong số các vector biểu hiện mạnh cho B. subtilis, vector pHT mang promoter Pgrac có tiềm năng để phát triển thành vector biểu hiện không sử dụng chất cảm ứng phù hợp với sản xuất qui mô lớn. Lí do là vì promoter Pgrac được tạo ra bằng cách dung hợp giữa promoter PgroES và operator lac,do đó plasmid pHT được kiểm soát biểu hiện bởi gene lacI trên plasmid trong khi đó nhiễm sắc thể E. coli có gene lacI và nhiễm sắc thể B. subtilis không có gene lacI.
Luận án thực hiện 2 nội dung chính, phát triển plasmid sao chép độc lập không sử dụng chất cảm ứng và vector sáp nhập và bộ gene B. subtilis không sử dụng chất cảm ứng. Trong nội dung đầu tiên, tổng cộng 21 plasmid sao chép độc lập được sử dụng. Trong đó, 5 plasmid lacI được dòng hoá trong đề tài này. Các plasmid lacI mang promoter Pgrac01, Pgrac57, Pgrac100, Pgrac212 kết hợp bgaB được sử dụng nhằm nghiên cứu sự biểu hiện BgaB không phụ thuộc vào chất cảm ứng IPTG. Mặc dù plasmid lacI làm tăng sự biểu hiện nền trong E. coli so với plasmid cảm ứng bằng IPTG nhưng chúng vẫn có khả năng ức chế sự biểu hiện nền. Plasmid lacI đã cho phép BgaB biểu hiện chiếm từ 14,6% - 31,1% tổng số protein nội bào trong B. subtilis. Các plasmid tự biểu hiện khác nhau với các mức độ biểu hiện khác nhau đã được tạo ra trong đề tài, đáp ứng các nhu cầu khác nhau về biểu hiện protein tái tổ hợp.
Trong nội dung thứ hai, tổng cộng 24 vector được sử dụng, trong đó, 11 vector mang promoter Pgrac01, Pgrac57, Pgrac100, Pgrac212 kết hợp với gene bgaB có khả năng sáp nhập vào bộ gene của B. subtilis ở locus amyE hoặc lacA được dòng hóa trong đề tài này. Các vector này được sử dụng để tạo ra 15 chủng B. subtilis nhằm nghiên cứu đặc điểm biểu hiện BgaB dưới sự kiểm soát của các promoter mạnh Pgrac được sáp nhập vào bộ gene khi không sử dụng chất cảm ứng. BgaB được biểu hiện bởi các chủng B. subtilis sáp nhập ở locus amyE hoặc lacA chiếm 7,2 - 42% tổng số protein nội bào. Chủng sáp nhập cassette biểu hiện sáp nhập vào cả 2 locus amyE và lacA có thể biểu hiện BgaB chiếm 23,4- 53,4% protein nội bào. Các vector biểu hiện sáp nhập không sử dụng chất cảm ứng khác nhau với các mức độ biểu hiện khác nhau đã được tạo ra trong đề tài, đáp ứng các nhu cầu khác nhau về biểu hiện protein tái tổ hợp.
2. Những kết quả mới của luận án
Luận án đã chứng minh cách tiếp cận mới để chuyển các plasmid cảm ứng biểu hiện thành plasmid không sử dụng chất cảm ứng bằng cách bất hoạt gene lacI trên plasmid, cho phép biểu hiện cao protein mục tiêu ở B. subtilis không sử dụng chất cảm ứng mà vẫn có khả năng ức chế biểu hiện nền ở E. coli.
3. Các ứng dụng/ khả năng ứng dụng trong thực tiễn hay những vấn đề còn bỏ ngỏ cần tiếp tục nghiên cứu
Các vectơ biểu hiện không sử dụng chất cảm ứng được tạo ra là một giải pháp hiệu quả về chi phí để sản xuất protein tái tổ hợp. Bên cạnh đó, một loạt các vector với nhiều mức độ biểu hiện khác nhau đã được tạo ra nhằm đáp ứng các yêu cầu khác nhau trong biểu hiện protein tái tổ hợp. Đáng chú ý, vector biểu hiện không sử dụng chất cảm ứng mang promoter Pgrac212 biểu hiện BgaB ở mức thấp trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy nhưng biểu hiện ở mức cao khi tế bào chủ vào giữa pha log. Những kết quả khả quan này cho thấy giá trị thương mại của các vector được xây dựng trong luận án.