Nghiên cứu cải tiến quy trình đông lạnh tế bào trứng bò nhằm nâng cao hiệu quả tạo phôi trong ống nghiệm - NCS. Nguyễn Thị Thương Huyền

 Ngành: Ngôn ngữ học so sánh đối chiếu
Mã số: 62 42 30 01
Họ tên nghiên cứu sinh: Nguyễn Thị Thương Huyền
Người hướng dẫn khoa học: TS. Hoàng Nghĩa Sơn; TS. Nguyễn Quốc Đạt
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG.HCM

1. Tóm tắt nội dung luận án
Mục tiêu của đề tài là cải tiến được quy trình đông lạnh tế bào trứng (TBT) bò bằng phương pháp thủy tinh hóa phù hợp với điều kiện Việt Nam nhằm góp phần nâng cao hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm từ TBT bò đông lạnh. Thu nhận TBT từ buồng trứng của bò cái bị giết mổ bằng phương pháp chọc hút. Những TBT có ít nhất từ 3 lớp cumulus và đồng nhất về tế bào chất được chọn để phục vụ cho các thí nghiệm. Nội dung 1: Khảo sát 3 quy trình đông lạnh đối với các TBT chín (quy trình 1 - cơ bản, quy trình 2 - quy trình 1 bổ sung 5% FCS, quy trình 3 - quy trình 2 bổ sung 1µM Taxol vào môi trường cân bằng, môi trường thủy tinh hóa và bổ sung 10% dung dịch acid Tyrode vào môi trường sau khi giải đông). Sau 22-24 giờ nuôi, chọn những TBT chín theo quan sát hình thái đem đông lạnh theo phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) trong cọng rạ qua 2 bước. TBT sẽ được cân bằng trong môi trường cân bằng trong 45 giây, chuyển tiếp qua môi trường thủy tinh hóa trong 25 giây, sau đó chuyển TBT vào cọng rạ (5-7 TBT/cọng rạ) trong vòng 30 giây. Các cọng rạ chứa TBT đưa thẳng vào hộp chứa nitơ lỏng, sau đó cho vào bình nitơ lỏng bảo quản lâu dài. Giải đông TBT qua 3 bước tương ứng với từng quy trình đông lạnh. Quá trình giải đông tiến hành ở nhiệt độ phòng (25oC). Sau khi giải đông, các TBT được tiếp tục nuôi ổn định thêm 2 giờ và tiến hành đánh giá các chỉ tiêu về tỉ lệ TBT sống trên TBT đông lạnh; tỉ lệ TBT sống trên TBT thu hồi và tỉ lệ TBT không bị tổn thương nhân. Chọn những TBT còn nguyên vẹn về hình thái đem thụ tinh trong ống nghiệm và thử nghiệm cấy truyền phôi cho bò cái mang. Kết quả cho thấy các TBT được bảo quản lạnh trong quy trình 3 đã nâng cao tỉ lệ sống, tỉ lệ thụ tinh cũng như phát triển của phôi sau khi thụ tinh trong ống nghiệm (64,51 ± 1,33%; 23,18 ± 1,76%; 5,71 ± 0,97%, tương ứng); cấy được 32 phôi cho 23 bò nhận, có 2 bê con ra đời. Nội dung 2: đánh giá việc nuôi chín in vitro và tạo phôi bằng kĩ thuật thụ tinh trong ống nghiệm từ nguồn tế bào trứng bò giai đoạn túi mầm (TBT GV) sau khi được bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa. Sử dụng cọng rạ và vi giọt làm vật mang, chất bảo vệ lạnh ethylene glycol (EG) kết hợp dimethyl sulfoxide (DMSO). Các TBT được bảo quản lạnh qua 2 bước: TBT được cân bằng trong dung dịch cân bằng (TCM–199 + 10% FBS + 5% FCS + 10% DMSO +10% EG) 45 giây, chuyển qua dung dịch thủy tinh hóa (TCM–199 + 10% FBS + 5% FCS + 20% DMSO + 20% EG + 0,5M Sucrose) 25 giây, sau cùng nạp các TBT vào cọng rạ (5-7 TBT/cọng rạ) hoặc tạo các vi giọt (5-7 TBT/vi giọt có thể tích từ 2-5µl), chuyển các cọng rạ và vi giọt chứa TBT vào bình nitơ lỏng trong vòng 30 giây kể từ khi TBT tiếp xúc với dung dịch thủy tinh hóa. Giải đông TBT qua 3 bước: môi trường rã đông thứ nhất (TCM-199 + 10% FBS + 0,25 M sucrose) trong 1,5 phút, môi trường rã đông thứ hai (TCM-199 + 10% FBS + 0,15 M sucrose) khoảng 1,5 phút và môi trường rã đông thứ ba (TCM-199 + 10% FBS) trong 5 phút. Quá trình giải đông tiến hành ở nhiệt độ phòng (25oC). Đánh giá tỉ lệ sống chết theo quan sát hình thái, sau đó một số được đánh giá theo phương pháp nhuộm AO/PI, số còn lại được nuôi chín in vitro trong môi trường N1 (TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + 10ng/ml EGF + 10IU/ml hCG + 0,2mM Natri pyruvate + 50µg/ml Gentamycin) và N2 (TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + 10ng/ml EGF + 10IU/ml hCG + 0,2mM Natri pyruvate + 50µg/ml Gentamycin bổ sung 10% dịch nang trứng) ở 38,5oC, 5% CO2 trong 20-24 giờ. Chọn các TBT chín đem thụ tinh trong ống nghiệm. Kết quả xét theo thứ tự từ nguồn cọng rạ và vi giọt lần lượt như sau: tỉ lệ sống theo hình thái đạt 69,30 ± 0,99% và 75,06 ± 0,94% (P < 0,001), tỉ lệ sống theo phương pháp nhuộm AO/PI đạt 52,69 ± 3,66% và 48,33 ± 3,72% (P > 0,05), tỉ lệ chín đạt 20,79 ± 1,38% và 12,79 ± 1,13% với P < 0,05; tỉ lệ thụ tinh (phôi 2 tế bào) đạt 15,64 ± 2,72% và 12,61 ± 3,15%; chỉ có 2/28 phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang (từ cọng rạ). Kết luận chung: Đã cải tiến được quy trình đông lạnh tế bào trứng bò giai đoạn MII bằng phương pháp thủy tinh hóa phù hợp với điều kiện Việt Nam: bổ sung 1µM Taxol vào môi trường cân bằng, môi trường thủy tinh hóa và bổ sung 10% dung dịch acid Tyrode vào môi trường sau khi giải đông bước 3. TBT bò ở giai đoạn GV sau khi bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa có thể nuôi chín in vitro trong môi trường cải tiến (N2 = TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + 10ng/ml EGF +  10IU/ml hCG + 0,2mM Natri pyruvate + 50µg/ml Gentamycin bổ sung 10% dịch nang trứng) và có thể tạo được phôi in vitro.

2. Những kết quả mới của luận án
Nghiên cứu thành công bảo quản lạnh TBT bò giai đoạn chín (metaphase II = MII) dùng cọng rạ, TBT bò giai đoạn túi mầm (germinal vesicle = GV) dùng cọng rạ và vi giọt theo phương pháp thủy tinh hóa;Nâng cao tỉ lệ sống của TBT MII sau k